地榆皂苷提取物（SSE）是地榆的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化等多种药理活性。然而，其对溃疡性结肠炎（UC）的治疗作用和潜在机制仍有待阐明。本研究旨在探讨SSE对UC的治疗效果、药效物质基础质量标志物（Q-Marker）和潜在的作用机制。我们将新鲜的2.5%葡聚糖硫酸钠盐（DSS）溶液置于饮用瓶中7天，以诱导UC小鼠模型，连续7天给小鼠灌胃补充SSE和柳氮磺吡啶（SASP），以研究SSE对UC的治疗作用；用LPS处理小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）和人正常结肠上皮细胞（NCM460）以诱导炎症反应，然后用不同浓度的SSE进行药效学评价。苏木精-伊红（HE）和阿尔新蓝染色评价小鼠结肠的病理损伤。我们采用脂质组学探索与UC发病过程紧密关联的不同脂质，采用定量PCR分析、免疫组织化学和ELISA试剂盒检测相应蛋白和促炎因子的表达水平。SSE处理可大大降低LPS刺激引起的RAW264.7和NCM460细胞中促炎因子的表达升高。研究之后发现，胃内给予SSE可显著减轻DSS诱导的结肠损伤的症状。SSE低极性皂苷，特别是ZYS-II，被证明是SSE治疗UC的主要活性物质。此外，SSE可以显著改善UC小鼠异常的脂质代谢。磷脂酰胆碱（PC）34:1在UC发病机制中的作用已在我们之前的研究中得到充分验证。在此，SSE有效逆转了UC小鼠中PC的代谢紊乱，并通过上调磷酸胆碱胞苷转移酶（PCYT1α）的表达，将PC34:1的水平提升到正常水平。我们的数据创新性地表明，SSE能够最终靠逆转DSS模型诱导的PC代谢紊乱来显著缓解UC的症状，是一种潜在的UC治疗候选药物。
译名：基于脂质代谢调节的地榆皂苷治疗溃疡性结肠炎质量标志物及分子机制研究
在中国、韩国和日本，地榆被用作治疗烧伤、吐血、黑便、肠道感染和皮炎的药用植物。据我们所知，地榆对UC的治疗作用尚未报道。本文用2.5%DSS诱导UC模型小鼠。为了探讨SSE的抗UC作用，UC小鼠灌胃SASP（阳性药物）、SSE混悬液或生理盐水7d，并被记录每天早上的体重。如图1A所示，UC小鼠的体重随着疾病的进展而大幅度的降低，SSE和SASP均明显恢复了体重减轻。结肠长度的缩短可以在某些特定的程度上反映结肠损伤的严重程度。UC模型可显著缩短结肠长度，SSE可明显缓解UC小鼠结肠长度的减少（图1B）。同时，HE染色根据结果得出，UC小鼠有显著的结肠损伤，包括肠上皮细胞的大量变性、坏死和脱落，以及黏膜和固有层的严重炎症细胞浸润。SSE或SASP的灌胃给药有效减轻了UC小鼠的结肠损伤（图1C）。肠杯状细胞可以产生和分泌黏液，形成结肠黏膜屏障，在UC疾病中发挥着至关重要的作用。我们用阿尔新蓝对小鼠结肠进行染色，根据结果得出对照组的结肠标本含有大量杯状细胞和大量黏液（图1D）。饮用含有DSS的水会破坏小鼠杯状细胞，进而导致黏液层厚度减少。重要的是，SSE和SASP处理显著逆转了DSS诱导的杯状细胞损失和黏液层变薄。一般来说，DSS导致小鼠中促炎因子的表达增加。在这里，我们测量了小鼠结肠中促炎因子的水平，以进一步探索SSE对UC的保护作用。显然，UC小鼠的促炎因子水平明显高于传统小鼠，而SSE和SASP明显降低了结肠促炎因子的表达（图1E至1G）。
（A）体重变化，（B）结肠和结肠长度的代表性图像，（C）H&E染色的结肠组织切片，（D）阿尔新蓝染色的结肠组织切片，（E）TNF-α水平，（F）IL-6水平，（G）IL-1β水平。与对照组相比，***P0.001，**P0.01，*P0.05；与模型组相比，###P＜0.001，##P＜0.01，#P＜0.05。
杯状细胞是分布在多个黏膜表面的特殊上皮细胞，通过黏液分泌在维持屏障方面发挥着至关重要的作用。此外，杯状细胞分泌抗菌蛋白、趋化因子和细胞因子，表明它们在先天免疫中的功能超过了维持屏障。各组结肠的阿尔新蓝染色表明，UC模型破坏了小鼠杯状细胞，导致黏液层厚度减少，SSE处理可以显著逆转这一现象。据报道，氯化氨甲酰胆碱（CCH）可刺激结肠杯状细胞收缩，促进黏液分泌。然后，我们在体外培养结肠组织，研究SSE对结肠杯状细胞黏液分泌的影响，并在这一过程中使用CCH作为阳性药物。显然，当CCH与结肠切片孵育40分钟时，大量黏液分泌到肠腔一侧（图2A）。然后我们将结肠组织与SSE（150μg/mL）孵育，并使用免疫荧光测定法测量MUC-2（黏蛋白）。根据结果得出，SSE与结肠切片孵育可以显著促进杯状细胞向肠腔侧分泌黏液（图2B）。我们测量了结肠组织两侧的电位差，以研究CCH和SSE对杯状细胞黏液分泌的影响。用CCH孵育40分钟可以大幅度增加结肠组织两侧之间的电位差。与CCH类似，与SSE（150μg/mL）孵育40分钟也可以大大增强结肠组织的电位差（图2C）。
为了进一步研究SSE对UC的治疗作用，我们在体外建立了LPS诱导的RAW264.7和肠内皮细胞NCM460的肠炎模型。RAW264.7细胞在LPS刺激下可产生一氧化氮（NO）并分泌一系列促炎细胞因子。NO是炎症部位分泌的重要细胞介质之一。如图2D所示，500 ng/mL的LPS显著提高了RAW264.7细胞中NO的产生，5至20 μg/mL的SSE可显著抑制NO的产生。此外，LPS处理的RAW264.7细胞产生了许多促炎因子，SSE可以显著降低TNF-α和IL-6水平的升高（图2E和F）。LPS刺激也大幅度提升了NCM细胞中炎症因子的水平，SSE可以有效减少LPS刺激引起的促炎细胞因子增加（图2G至2I）。
在之前的研究中，我们共从SSE中鉴定出41种皂苷。为了快速筛选SSE中的活性成分，我们通过制备型高效液相色谱法（pre-HPLC）制备了SSE的4个不同极性组分。在此过程中，我们通过岛津HPLC 20AD系统分离和分析SSE溶液（1 mg/mL），并分别在2.5-9分钟（P1）、9-12.5分钟（P2）、12.5-15.5分钟（P3）和15.5-22.5分钟（P4）时切换电磁开关阀，自动收集4个连续片段（图3A）。我们将上述分离重复20次，之后将收集的馏分在旋转蒸发器中干燥。然后，我们将干燥的组分用细胞培养基重新溶解。接下来，我们比较P1、P2、P3和P4对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用，以筛选SSE的线溶液与LPS处理的RAW264.7细胞孵育12小时后，测量细胞活力。结果表明，P2、P3和P4可以显著逆转LPS诱导的细胞毒性，但P1对细胞活力没有明显影响（图3B）。显然，随着极性的降低，SSE中成分的抗炎活性逐渐增加。地榆皂苷I（ZYS-I）和地榆皂苷II（ZYS-II）是SSE中的主要皂化物，ZYS-I极性远大于ZYS-II。ZYS-I和ZYS-II的保留时间分别为8.7和14.2分钟。为了进一步验证SSE的极性与其抗炎作用之间的关系，我们比较了ZYS-I和ZYS-II的药理活性。如图3C和3D所示，极性较大的ZYS-I的抗炎作用不明显，而极性较小的ZYS-II可以以剂量依赖的方式发挥抗炎作用。因此，SSE的抗UC作用可能主要归因于其低极性成分。此外，我们还研究了SSE处理后ZYS-I和ZYS-II在对照小鼠和UC模型小鼠中的药代动力学。在给予50 mg SSE后6小时，与对照组相比，UC小鼠中ZYS-I和ZYS-II的暴露量显著增加（图3E和F）。回肠和结肠中ZYS-I的浓度远高于其他组织。特别是，ZYS-I在UC小鼠回肠中的浓度约为对照小鼠的5倍，而其在UC小鼠结肠中的浓度为正常小鼠的100倍（图3E）。与ZYS-I类似，ZYS-II主要分布在胃肠道，尤其是空肠、回肠和结肠（图3F），这与ZYS-II改善UC的疗效一致。
（A）来自SSE的四种pre-HPLC产物的保留时间间隔，（B）细胞活力，（C-D）NO水平，（E）ZYS-I的组织分布，（F）ZYS-II的组织分布。
中药的化学复杂性和靶点多样性一直阻碍着其药效机制的研究。最近，“组学”技术被广泛用于阐明中药的生物学基础。本文采用基于LC-QTOF/MS和LC-MS/MS系统的定性和定量脂质组学技术，探索与UC小鼠疾病过程密切相关的差异脂质，为SSE抗UC作用机制的后续研究做准备。227种脂质，分属12类，主要包括5种酰基肉碱（ACars）、5种胆固醇酯（CEs）、64种磷脂酰胆碱（PCs）、102种甘油三酯（TAGs）、14种鞘磷脂（SMs）、13种磷脂酰乙醇胺（PEs）、10种溶血磷脂酰胆碱(LPCs)，1个磷脂酰甘油（PG）和1个磷脂酰基丝氨酸（PS）（支持信息图S1）。通过对UC和对照小鼠血清中脂质组学的OPLS-DA分析，我们筛选出变量投影重要性（VIP）值1的脂质。结果显示，VIP值1的脂质主要是PCs和TAGs，与对照小鼠相比，UC小鼠血清中大多数PCs的含量明显降低（图4A和B）。通过对UC和SSE处理小鼠血清中脂质组学的OPLS-DA分析，我们获得相应的VIP值，并筛选出VIP值1的脂质。结果显示，VIP值1的脂质主要是PCs和TAGs，SSE给药小鼠血清中大多数PCs的含量显著高于UC模型小鼠（图4C）。我们还对UC建模和SSE给药对小鼠血清中脂质组学的调节作用进行了PCA分析。显然，UC建模导致了脂质组学的显著偏差，而SSE给药可以纠正UC小鼠血清中脂质组学上的偏差（图4D）。特别是UC小鼠血清中的PC34:1和PC34:2水平仅为对照组血清中的1/2。SSE可以明显逆转PC34:1和PC34:2水平的下降（图4E）。此外，与对照小鼠相比，UC小鼠血清中大多数TAGs的含量显著降低，而SSE显著逆转了这些TAGs的降低（图4F）。
（A-B）与模型小鼠相比，正常小鼠血清中每种脂质的可变重要性（VIP）值。红色部分表示VIP值大于1的脂质，（C）与SSE给药的小鼠相比，模型小鼠血清中每种脂质的可变重要性（VIP）值。红色部分表示VIP值大于1的脂质，（D）小鼠血清脂蛋白的PCA分析，（E）小鼠血清中PC的相对水平，（F）小鼠血清TAG的相对水平。与对照组相比，***P0.001，**P0.01，*P0.05；与模型组相比，###P＜0.001，##P＜0.01，#P＜0.05。
我们还研究了对照、DSS处理和SSE处理小鼠的结肠脂质组学，以确定SSE治疗UC的靶点。我们共鉴定出11类232种脂质，主要包括5种双（单油酰甘油）磷酸酯（BMPs）、4种ACars、1种CE、49种PCs、70种TAGs、6种SMs、46种PEs、12种LPCs、24种DAGs、8种LPEs和7种CERs（支持信息图S2）。PCA分析显示，UC小鼠中的脂质组学与对照小鼠显著偏离，SSE给药对UC模型小鼠结肠中的脂质组织学具有明显的调节作用（图5A）。与血清中脂质组学的结果一致，UC小鼠结肠中PC34:1和PC34:2的水平显著降低，SSE给药可以明显恢复这些PC的含量（图5B）。此外，UC建模也显著降低了主要的TAGs，SSE可以逆转TAGs水平（图5C和D）。
目前，成像质谱显微镜（iMScope）（日本京都岛津）被证明在评估组织切片和细胞中内源性和外源性成分的空间分布方面具有巨大潜力。在此，我们使用iMScope研究了PC34:1和PC34:2的空间分布。显然，UC小鼠结肠PC34:1和PC34:2的MS强度远低于对照组，SSE处理显著恢复了这些PCs的含量（图6）。
我们之前的研究表明，PC34:1的含量很高，与UC疾病密切相关，补充PC34:1通过增加UC小鼠结肠中延胡索酸盐的含量，发挥了很大的抗UC作用。因此，SSE对UC的治疗作用可能与其增加PC34:1含量的能力有关。因此，我们进一步研究了SSE对PC合成酶的调节作用，以探讨SSE治疗UC的机制。PC在体内有两种主要的合成途径，一种是CDP胆碱（Kennedy）途径，另一种是由磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）介导的PE转化途径（图7A）。CHKα和CHKβ是两种ATP依赖性胆碱激酶，它们将胆碱转化为磷酸胆碱（p-胆碱）。与对照组相比，UC小鼠的结肠CHKα水平显著升高，SSE可将CHKα的表达降至常规水平（图7B）。UC建模和SSE给药均未对CHKβ的表达水平产生显著影响（图7C）。磷酸胆碱胞苷转移酶（PCYT1α）是Kennedy途径中的限速酶，可将P-胆碱转化为活性核苷酸CDP胆碱。与对照组相比，模型组的PCYT1α表达显著降低，SSE可将UC小鼠结肠中PCYT1 a的水平上调4倍（图7D）。更重要的是，Kennedy通路也参与了小鼠或人类TAG的合成，PCYT1α的失活与TAG分泌的减少有关。因此，UC模型小鼠和SSE处理小鼠TAG水平的变化可能是由于UC模型和SSE调节了PCYT1α的表达。胆碱/乙醇胺磷酸转移酶（CEPT）是一种在内质网中表达的膜蛋白，催化CDP胆碱合成PC。UC小鼠和对照小鼠的CEPT表达相当，SSE给药对CEPT的调节作用也不显著（图7E）。此外，与对照组相比，模型组结肠中PEMT的表达显著降低，而SSE对PEMT水平没有显著影响（图7F）。
（A）PC生物合成途径。（B）CHKα水平，（C）CHKβ水平，（D）PCYT1α水平，（E）CEPT水平，（F）PEMT水平。
UC是一种慢性炎症性疾病，主要表现为结肠和直肠的弥漫性炎症反应。UC通常被认为是由遗传、环境和肠道微生物群等多种因素引起的。如今，全球UC的患者发病率都在上升，一些抗炎药和免疫抑制剂已被用于UC的治疗。除了常规治疗外，目前研究者还尝试了白细胞单药治疗、无机亚硝酸盐或硝酸盐以及粪菌治疗。然而，上述所有治疗策略都有其自身的副作用，无法达到治疗的最终目的，即保持长期缓解。随着全球UC发病率的上升，我们迫切需要更多的UC治疗方案。近年来，草药因其副作用低、可用性好和成本效益高的优点，在世界各地被用于治疗各种疾病。与5-氨基水杨酸相比，许多中草药显示出显著的疗效。据报道，在草药中，地榆具有抗氧化、抗感染、抗炎、抗过敏和抗肿瘤的作用。据我们所知，地榆对UC的治疗作用尚未被报道。本文利用地榆的主要活性成分SSE研究其对UC的治疗作用，为地榆的基础研究和临床应用提供一些新的见解。
DSS诱导的UC小鼠是广泛使用的模型动物，其临床和形态学特征与人类UC非常相似。我们发现，SSE灌胃给药显著减轻了DSS诱导的体重减轻、结肠缩短和组织病理学损伤的临床特征。先前的实验证据表明，炎性细胞因子的增加加重了UC的疾病进展。抗炎药如5-氨基水杨酸盐和可以抑制促炎因子的过度释放，以改善UC患者的症状。研究发现，SSE可显著减轻DSS诱导的UC小鼠中促炎细胞因子的过度产生。此外，我们使用LPS诱导的炎症细胞模型进一步验证SSE对UC的药理活性。根据结果得出，外源性SSE可显著降低炎症性RAW264.7和NCM460细胞中促炎因子的水平。结肠黏液是肠道屏障功能的主要组成部分，将上皮与外部环境分离，是维持体内平衡的动态屏障。杯状细胞产生的黏液层保护蛋白可以保护肠道免受病原体的侵害，而UC患者的病原体数量急剧减少。一项研究表明，葛根素通过重建DSS诱导的UC中的黏液层来发挥抗结肠炎作用。我们的数据表明，SSE可以显著促进杯状细胞中黏液向肠腔一侧的分泌，并增强结肠组织两侧之间的电位差。此外，LPS在UC、败血症和感染性休克等多种炎症性疾病中发挥着至关重要的作用。LPS诱导的RAW264.7细胞经常用于研究UC的药物疗效和作用机制。在此，我们研究了SSE对LPS诱导的RAW264.7细胞模型的抗炎活性，结果证明SSE可以显著降低LPS引起的TNF-α和IL-6水平的升高。总体而言，所有这些结果表明，SSE可能被开发为UC的天然有效候选制剂。
UC的发病机制是由多种生物过程的复杂相互作用紊乱引起的。此外，SSE的成分复杂，其对UC的治疗靶点也可能多种多样。对UC的发病机制和SSE的治疗靶点的全面理解最终需要在系统生物学的框架内结合多组学和非组学验证的综合方法。脂质是一种重要的生命必需化合物，具有重要的生理功能，广泛分布于生物体内。脂质组学是代谢组学的一个子集，用于通过多个分析细胞识别和量化内源性脂质，这有可能促进新的生物标志物发现和治疗开发计划。在脂质组学领域，具有独特m/z和保留时间的离子峰被称为特征，与广泛的数据库相匹配，以识别特定的脂质。一般来说，炎症反应是由几个充当细胞信使的脂质亚类介导的。最近的一系列研究通过探索脂质代谢的变化，分析了与炎症反应相关的特定生物标志物。研究表明，慢性炎症与较低的脂质水平有关，治疗后炎症消退后可能会观察到脂质增加。例如，PC参与了哺乳动物细胞膜的形成，并参与了肠道黏液层的代谢平衡。与克罗恩病和对照组相比，UC患者肠道黏液中PC和LPC的含量显著降低。我们最近的研究证明PC34:1在UC的疾病进展中起着重要作用。PC34:1补充剂通过提高延胡索酸盐的含量显示出良好的抗UC作用。本研究鉴定了小鼠血清中的227种脂质和小鼠结肠中的232种脂质。我们发现DSS建模导致了脂质组学的显著偏差，而SSE可以纠正UC小鼠的脂质组学偏差。UC小鼠的PCs和TAGs显著降低，SSE显著恢复了这些脂质的水平。无论在血清还是结肠中，UC小鼠的PC34:1水平仅为对照组的1/2左右。更重要的是，SSE显著逆转了UC模型导致的PC34:1降低。对于脂质组学分析，LC-MS是最常用的方法，因为它可以同时分离和检测各种脂质。然而，在样品制备过程中，组织需要均质化和提取，脂质的空间分布信息不可避免地会丢失。为了进一步验证SSE对PC的调节，我们使用iMScope研究了PC34:1和PC34:2的空间分布。与脂质组学分析的定量结果一致，UC小鼠结肠PC34:1和PC34:2的MS强度远低于对照组，SSE显著恢复了这些PCs的含量。
PC是真核细胞膜的主要成分，也是脂质第二信使的重要来源。1956年，Kennedy等人阐明了PE和PC的从头生物合成途径。CHKα和CHKβ可以将胆碱转化为磷酸胆碱（p-胆碱），这是CDP胆碱（Kennedy）途径的第一步。下一步是通过PCYT1α将p-胆碱转化为活性核苷酸CDP胆碱，这一步骤被认为是PC合成途径中的限速步骤。最后一步是在CEPT酶的催化下将CDP胆碱转化为PC。此外，PE使用一种或多种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，在PEMT的催化下，通过乙醇胺头基团的三次连续甲基化转化为PC。本研究测量了参与PC合成的代谢酶，包括CHKα、CHKβ、PCYT1α、CEPT和PEMT，以研究UC和SSE对PC的调节机制。我们的结果显示，UC模型导致小鼠结肠中PCYT1α的显著下调，而SSE可使UC小鼠结肠中PCYT1α的表达上调4倍。Kennedy通路也参与了小鼠或人类TAGs的合成，并且PCYT1的失活在基因上与TAG分泌的减少有关。因此，UC模型小鼠和SSE处理小鼠TAGs水平的变化可能是由于UC模型和SSE处理对PCYT1α的调节。
近几十年来，药理学研究表明，地榆中的生物活性成分最重要的包含单宁、黄酮类化合物、类固醇和皂苷。地榆皂苷是地榆中的一组主要萜类成分，是地榆的主要活性成分。在本研究中，个人会使用pre-HPLC法制备了SSE的不同极性组分，以快速筛选SSE的活性成分。我们的研究结果表明，地榆皂苷在SSE中的抗炎活性随着其极性的降低而逐渐增加。SSE对UC的治疗作用可能与其低极性皂苷有关。地榆皂苷I和地榆皂苷II是地榆皂苷的特征成分，尤其是地榆皂苷II的甲酯形式可以调节高脂血症状态和炎症反应，治疗乳腺癌症，改善抗糖尿病特性，对2型糖尿病具有肝肾保护作用。在我们的色谱分离条件下，ZYS-I和ZYS-II的保留时间分别为8.7分钟和14.2分钟。为了进一步验证地榆皂苷的极性与其抗炎作用之间的关系，我们比较了ZYS-I和ZYS-II的抗炎作用。极性较大的ZYS-I的抗炎作用不明显，而极性较小的ZYS-II的抗炎作用呈剂量依赖性。更重要的是，ZYS-II主要分布在小鼠的胃肠道，尤其是空肠、回肠和结肠，这与ZYS-II对UC的治疗效果一致。因此，SSE中的低极性皂苷，特别是ZYS-II，是地榆治疗UC的活性物质。
UC是一种慢性炎症性肠病，主要发生在结肠或直肠。近年来，随着生活水平的不断提高，东亚人群UC的发病率稳步上升。然而，UC临床治疗中常用的药物仍存在不同的缺点，包括复发、多种不良反应和疗效差。在本研究中，SSE首次被证明是一种有前景且有效的UC治疗候选药物，可以显著缓解DSS诱导的UC症状。UC的发病机制是由多种生物过程的复杂相互作用紊乱引起的。我们之前的研究证明PC34:1在UC的疾病进展中发挥了重要作用。在此，SSE被发现可以有效逆转UC小鼠的PC代谢紊乱，并通过上调小鼠结肠中的PCYT1α将PC34:1水平提高到正常水平。此外，我们的研究根据结果得出，SSE中的低极性皂苷，特别是ZYS-II，是地榆治疗UC的主要活性物质。本研究为地榆治疗UC的临床应用提供了科学支持。我们希望这项工作将有助于从地榆皂苷中开发新的UC治疗剂。
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